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                      檢測宿主細(xì)胞DNA殘留的新方法:dPCR技術(shù)

                      更新時間:2023-07-19  |  點擊率:566

                       

                      數(shù)字PCRDigital PCR)是一種基于單分子水平的PCR擴(kuò)增技術(shù),旨在準(zhǔn)確測量目標(biāo)分子的數(shù)量。相對于傳統(tǒng)的定量PCR技術(shù),dPCR通過將PCR反應(yīng)混合物分割成更小的單元,使每個單元中只有一個目標(biāo)分子,從而提高了準(zhǔn)確性和靈敏度。下面是dPCR技術(shù)的詳細(xì)解釋:

                       

                      樣品分割:

                      dPCRPCR反應(yīng)混合物分割成許多小區(qū)域(例如微滴、陣列或芯片孔),使每個區(qū)域中只有一個目標(biāo)分子或沒有目標(biāo)分子。這種樣品分割使每個分割區(qū)域的PCR反應(yīng)相互獨立,消除了反應(yīng)競爭的影響。

                       

                      擴(kuò)增:

                      在每個樣品分割區(qū)域中,PCR反應(yīng)通過加入引物、酶和核苷酸等組分進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增可以使用傳統(tǒng)的PCR方法,例如熱循環(huán)PCRthermal cycling PCR)或滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification)等。關(guān)鍵的一點是,擴(kuò)增過程中的分子數(shù)目是已知的,因為每個分割區(qū)域只有一個目標(biāo)分子或沒有目標(biāo)分子。

                       

                      信號檢測:

                      為了確定每個分割區(qū)域是否含有目標(biāo)分子,通常會使用熒光標(biāo)記或探針來檢測PCR產(chǎn)物的存在與否。熒光信號可以通過熒光顯微鏡或熒光檢測設(shè)備進(jìn)行測量。根據(jù)信號的有無,可以將每個分割區(qū)域標(biāo)記為陽性(含有目標(biāo)分子)或陰性(不含目標(biāo)分子)。

                       

                      數(shù)據(jù)分析:

                      通過統(tǒng)計每個分割區(qū)域的陽性和陰性數(shù)量,可以計算出目標(biāo)分子的絕對數(shù)量。這通常使用Poisson分布模型進(jìn)行計算。通過測量多個分割區(qū)域的結(jié)果,可以獲得更準(zhǔn)確的目標(biāo)分子數(shù)量,并估計其濃度。

                       

                      dPCR技術(shù)的優(yōu)點:

                       

                      更高的靈敏度:dPCR可以檢測極低豐度的目標(biāo)分子,即使在稀有突變或低拷貝數(shù)的情況下也能準(zhǔn)確測量。

                      更高的準(zhǔn)確性:由于每個分割區(qū)域是獨立擴(kuò)增和檢測的,dPCR對抑制物的影響較小,結(jié)果更可靠。

                      更寬的動態(tài)范圍:dPCR具有較廣的線性范圍,可以檢測從低拷貝數(shù)到高拷貝數(shù)的目標(biāo)分子。

                      無需標(biāo)準(zhǔn)曲線:與定量PCR不同,dPCR不需要依賴外部標(biāo)準(zhǔn)曲線,而是直接計數(shù)目標(biāo)分子的存在與否。

                      dPCR技術(shù)的應(yīng)用:

                       

                      突變檢測:dPCR可以檢測罕見突變,用于腫瘤早期診斷、監(jiān)測病毒突變等。

                      基因表達(dá)分析:dPCR能夠準(zhǔn)確測量不同基因的表達(dá)水平,并檢測低豐度的轉(zhuǎn)錄變異。

                      病原體檢測:dPCR的高靈敏度和準(zhǔn)確性使其成為檢測感染病原體的理想工具。

                      遺傳疾病篩查:dPCR可用于檢測染色體異常、單基因疾病等遺傳疾病的診斷和篩查。

                      總結(jié):

                      數(shù)字PCRdPCR)是一種利用樣品分割和單分子擴(kuò)增的技術(shù),能夠準(zhǔn)確測量目標(biāo)分子的數(shù)量。它具有高靈敏度、準(zhǔn)確性和寬動態(tài)范圍等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域的分子生物學(xué)研究和診斷中。


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