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                      支原體常規(guī)檢測(cè)方法匯總(三)

                      更新時(shí)間:2021-11-25  |  點(diǎn)擊率:599

                      細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中支原體檢測(cè)方法如約而至

                      第三期來(lái)啦!

                      還沒(méi)有看前兩期內(nèi)容的小伙伴

                      可以看我之前發(fā)的:支原體常規(guī)檢測(cè)方法匯總(一)、支原體常規(guī)檢測(cè)方法匯總(二)

                      上回書(shū)和上上回書(shū)說(shuō)道

                      qPCR檢測(cè)法是一種目前比較常用

                      效果也比較可靠的方法

                      那除了qPCR

                      還有沒(méi)有其他方法可以檢測(cè)呢?


                      所以今天就來(lái)講講

                      分離培養(yǎng)法和DNA染色法

                      有請(qǐng)兩位主角閃亮登場(chǎng)

                      01、分離培養(yǎng)法

                      簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō),這種方法的基本原理就是:分離,然后培養(yǎng)

                      聽(tīng)君一席話(huà)如聽(tīng)一席話(huà),展開(kāi)來(lái)講,就是從可疑的細(xì)胞培養(yǎng)體系中取樣,接種到適宜支原體生長(zhǎng)的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體,它們就會(huì)在這種瓊脂平板上快速生長(zhǎng),最終形成明顯可見(jiàn)的特征性菌落。

                      操作規(guī)范的情況下,這種方法很少會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果,檢測(cè)精確度很高,因此被譽(yù)為支原體檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。

                      缺點(diǎn)就是檢測(cè)時(shí)間太長(zhǎng),支原體要長(zhǎng)出明顯克隆至少需要4周時(shí)間。另一方面,盡管可以檢測(cè)絕大多數(shù)支原體種類(lèi),分離培養(yǎng)法也有力所不及的時(shí)候,例如支原體M. Hyorhinis。因此,該方法能鑒定的支原體種類(lèi)有限,成為它的另一個(gè)缺點(diǎn)。

                      02、DNA染色法

                      該方法的實(shí)驗(yàn)思路是:培養(yǎng)指示細(xì)胞、樣品上清液收集、上清液接種、染色觀察結(jié)果

                      這一波操作看起來(lái)有點(diǎn)復(fù)雜,那展開(kāi)說(shuō)說(shuō):

                      將供試品接種于指示細(xì)胞(無(wú)污染的Vero 細(xì)胞或經(jīng)國(guó)家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他細(xì)胞,供試品應(yīng)對(duì)該細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響。下面以Vero細(xì)胞為例)中培養(yǎng)后,用特異熒光染料(如Hoechst 33258)染色,支原體中的核酸也可以被著色,因此,如果待檢測(cè)細(xì)胞中含有支原體,那么就會(huì)導(dǎo)致指示細(xì)胞被感染,進(jìn)而在細(xì)胞膜或培養(yǎng)基等處發(fā)現(xiàn)藍(lán)色熒光(支原體附著在細(xì)胞膜上,也有可能游離在細(xì)胞培養(yǎng)基中)。

                      指示細(xì)胞培養(yǎng):將指示細(xì)胞復(fù)蘇、傳代,調(diào)整至最佳狀態(tài),留出適宜的量備用。

                      樣品上清液收集:無(wú)抗生素培養(yǎng)基中加入待檢測(cè)樣品后,細(xì)胞需至少傳一代,然后取細(xì)胞已長(zhǎng)滿(mǎn)且3 天未換液的細(xì)胞培養(yǎng)上清液待檢。(為了對(duì)待檢測(cè)樣品中的支原體進(jìn)行富集)

                      上清液接種:在制備好的指示細(xì)胞培養(yǎng)板中加入一定量的待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清,36°C培養(yǎng)3-5 天。指示細(xì)胞培養(yǎng)物至少傳代1 次,末次傳代培養(yǎng)可用6孔板培養(yǎng)3-5 天。

                      染色觀察:吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液,加入固定液,放置5分鐘。吸出固定液后進(jìn)行10min的二次固定,再次吸出固定液,使蓋玻片在空氣中干燥。加DNA 染料工作液5ml,加蓋,室溫放置30分鐘,漂洗3次,干燥,封片。用熒光顯微鏡觀察。

                      熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞表面或培養(yǎng)基中,有大小不等、不規(guī)則的藍(lán)色熒光著色顆粒,則說(shuō)明有可能存在支原體污染。

                      對(duì)于DNA染色法方法,優(yōu)缺點(diǎn)也是很明顯的:

                      優(yōu)點(diǎn):

                      1、適用于一些不易培養(yǎng)的支原體,如豬鼻支原體,分離培養(yǎng)法對(duì)該支原體檢測(cè)并不可靠,但可用DNA染色法準(zhǔn)確地檢測(cè)出來(lái)。

                      2、操作步驟雖然多,但都相對(duì)簡(jiǎn)單

                      3、靈敏度尚可。

                      缺點(diǎn):

                      1、時(shí)間較長(zhǎng),從Vero細(xì)胞復(fù)蘇、傳代,再到收集上清后再次培養(yǎng),有時(shí)甚至需要十幾天時(shí)間

                      2、存在假陽(yáng)性和假陰性的可能:如一些死亡細(xì)胞釋放出來(lái)的DNA會(huì)被染成藍(lán)色,出現(xiàn)假陽(yáng)性;或是由于熒光過(guò)若而出現(xiàn)假陰性使結(jié)果出現(xiàn)偏差,因此使用這個(gè)方法需要一定的經(jīng)驗(yàn)。


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