培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證細(xì)胞生存的首要條件。當(dāng)細(xì)胞放置于體外培養(yǎng)時(shí)，與體內(nèi)相比細(xì)胞丟失了對(duì)微生物 和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此在進(jìn)行培養(yǎng)中，保持細(xì)胞生存環(huán)境無污染、代謝物及時(shí)清除等，是維持細(xì)胞生存的基本條件。

一、無菌室

無菌室的結(jié)構(gòu)：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。

無菌室的消毒和防污染：為保持無菌狀態(tài)，經(jīng)常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（1－2小時(shí)），每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時(shí)）和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒。實(shí)際工作中，要根據(jù)無菌室建筑材料的差異來選擇合適的消毒方法。

此外，還應(yīng)注意防止無菌室的污染。造成無菌室污染的可能包括：送入無菌室的風(fēng)沒有被過濾除菌；進(jìn)出無菌室時(shí)，能使外界空氣直接對(duì)流進(jìn)無菌室的操作間；等。

二、超凈工作臺(tái)

工作原理：鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過高效過濾器得以凈化，凈化的空氣被徐徐吹過臺(tái)面空間而將其中的塵埃、細(xì)菌甚至病毒顆粒帶走，使工作區(qū)構(gòu)成無菌環(huán)境。根據(jù)氣流在超凈工作臺(tái)的流動(dòng)方向不同，可將超凈工作臺(tái)分為側(cè)流式、直流式和外流式三種類型。

超凈臺(tái)的使用與保養(yǎng)：超凈臺(tái)的平均風(fēng)速保持在0.32-0.48米/秒為宜，過大、過小均不利于保持凈化度；使用前最好開啟超凈臺(tái)內(nèi)紫外燈照射10－30分鐘，然后讓超凈臺(tái)預(yù)工作10－15分鐘，以除去臭氧和使用工作臺(tái)面空間呈凈化狀態(tài)；使用完畢后，要用70%酒精將臺(tái)面和臺(tái)內(nèi)四周擦拭干凈，以保證超凈臺(tái)無菌。還要定期用福爾馬林熏蒸超凈臺(tái)。

德國MB生產(chǎn)的Mycoplasma-offTM噴霧劑，或濕巾擦拭 5-10分鐘清除，對(duì)支原體、細(xì)菌、真菌、霉菌、孢子祛除確切有效。無殘留, 無腐蝕, 無致癌性，操作簡單方便。

qPCR法介紹：

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，將『針對(duì)支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記，使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號(hào)的變化和配套軟件，進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測，簡稱qPCR。

優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高、特異性強(qiáng)。

②時(shí)間短，2-3小時(shí)出結(jié)果。

③檢測結(jié)果可定量。

④操作簡便。

缺點(diǎn)：①對(duì)于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽性。（可用培養(yǎng)法做補(bǔ)充驗(yàn)證）

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計(jì)不同），需謹(jǐn)慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。