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                      【支原體核酸法】用定量標(biāo)準(zhǔn)品

                      更新時(shí)間:2020-08-24  |  點(diǎn)擊率:1272

                      目前,支原體核酸檢測法(常規(guī)PCR、熒光定量PCR)應(yīng)用較為廣泛,尤其在生物制藥和細(xì)胞治療領(lǐng)域,可以替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和DNA染色法。但同時(shí),各種品牌的支原體PCR和qPCR檢測試劑盒又良莠不齊,因此,對核酸法本身進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證是非常必要的。

                       

                      上對支原體核酸法的驗(yàn)證提出了三項(xiàng)要求:檢測限、特異性和耐用性。在檢測限方面,歐洲藥典除了規(guī)定要達(dá)到10CFU/ml或100CFU/ml外,也指出可以用等量的支原體核酸拷貝數(shù)來表示。這時(shí)就需要選用合適的支原體核酸標(biāo)準(zhǔn)品。

                       

                      的微生物污染防控公司Minerva Biolabs(以下簡稱德國MB公司),專門提供包括歐洲/日本藥典9種支原體在內(nèi)的PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品共14種,可進(jìn)行10倍梯度稀釋,制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定核酸法的檢測限,因而廣受藥廠的青睞。

                      德國MB公司提供的PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品信息如下:

                      德國MB公司提供的PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品信息如下:

                      PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品的物種

                      貨號

                      口腔支原體

                      52-0112

                      雞敗血支原體

                      52-0115

                      萊氏無膽甾原體

                      52-0116

                      發(fā)酵支原體

                      52-0117

                      肺炎支原體

                      52-0119

                      關(guān)節(jié)液支原體

                      52-0124

                      精氨酸支原體

                      52-0129

                      豬鼻支原體

                      52-0130

                      檸檬螺原體

                      52-0164

                      唾液支原體

                      52-0103

                      百日咳桿菌

                      52-5571

                      大腸埃希菌

                      52-0083

                      嗜肺軍團(tuán)菌

                      52-0101

                      銅綠假單胞菌

                      52-0071

                       

                       

                       

                      一、試劑盒組分:

                      試劑盒組分

                      數(shù)量

                      蓋子顏色

                      PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品

                      1×108基因組拷貝/管

                      1管凍干粉

                      綠色

                      Tris緩沖液,10mM Tris,pH8.5(用于溶解和稀釋標(biāo)準(zhǔn)品)

                      2ml×3管

                      白色

                       

                      說明:2-8℃保存。使用前,標(biāo)準(zhǔn)品溶解后在-18℃以下保存。避免反復(fù)凍融。

                       

                      、質(zhì)控保證

                       

                      微生物在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),并在對數(shù)生長期末期收集。DNA用酚氯fang抽提,繼而用過濾柱純化。DNA純度用分光光度計(jì)法測量,保證OD260/280≥1.8。微生物物種用Sanger測序法確定。

                       

                      純化DNA的定量采用小牛胸腺DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行光密度測量,進(jìn)而用熒光法證實(shí)。DNA終稀釋,并調(diào)整為1×108基因組拷貝/管。稀釋倍數(shù)用qPCR分析證實(shí)。

                      每個(gè)批號的產(chǎn)品均提供質(zhì)控證明。

                      三、操作步驟:

                      1、標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶

                      (1)所有管短時(shí)離心。

                      (2)加入100μl Tris緩沖液到帶綠蓋的管中。

                      (3)室溫靜置5分鐘。

                      (4)渦旋振蕩10秒,再離心5秒。

                      (5)使用適當(dāng)體積的DNA溶液直接用于PCR或直接稀釋,用于制備DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

                      2、制備10倍稀釋的DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

                      (1)使標(biāo)準(zhǔn)品和Tris緩沖液室溫達(dá)到平衡。

                      (2)標(biāo)記每個(gè)1.5ml離心管。每個(gè)管加入90ml Tris緩沖液。

                      (3)標(biāo)準(zhǔn)品混勻離心。

                      (4)標(biāo)準(zhǔn)品1:加10μl標(biāo)準(zhǔn)品母液到第1管,蓋蓋并混勻。簡要離心。

                      (5)標(biāo)準(zhǔn)品2:從第1管中取出10μl到第2管,蓋蓋并混勻。簡要離心。

                      (6)標(biāo)準(zhǔn)品3:從第2管中取出10μl到第3管,蓋蓋并混勻。簡要離心。

                      (7)下面的管均重復(fù)以上步驟。推薦制備6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品(梯度稀釋)。

                      3、PCR擴(kuò)增

                      溶解的DNA可直接用于常規(guī)PCR。德國MB公司推薦Venor®GeM PCR試劑盒用于支原體檢測,或Onar®

                      Bacteria PCR試劑盒用于細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)菌檢測。

                      對于qPCR,使用梯度稀釋的DNA標(biāo)準(zhǔn)品,可制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。大多數(shù)qPCR軟件允許通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。這依賴于正確的設(shè)置,包括標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)。為便于正確定量,要確定你的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。使用者可以試用下列參數(shù)用于設(shè)置。體積決定了每個(gè)PCR反應(yīng)的基因組拷貝數(shù)。

                       

                      反應(yīng)管編號

                      2μl樣品

                      5μl樣品

                      10μl樣品

                      1

                      2×105基因組拷貝

                      5×105基因組拷貝

                      1×106基因組拷貝

                      2

                      2×104基因組拷貝

                      5×104基因組拷貝

                      1×105基因組拷貝

                      3

                      2×103基因組拷貝

                      5×103基因組拷貝

                      1×104基因組拷貝

                      4

                      200基因組拷貝

                      500基因組拷貝

                      1000基因組拷貝

                      5

                      20基因組拷貝

                      50基因組拷貝

                      100基因組拷貝

                      6

                      2基因組拷貝

                      5基因組拷貝

                      10基因組拷貝

                       

                      4、評估

                      使用梯度稀釋,qPCR檢測后Ct值會(huì)隨著DNA濃度下降而升高。通過Ct值和DNA樣本量產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,未知樣本的濃度通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算。下列的擴(kuò)增曲線是用德國MB公司的Venor®

                      GeM qEP試劑盒繪制的。所用儀器為CFX96 Touch熒光定量PCR儀。

                      圖1. 梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線。標(biāo)準(zhǔn)品為發(fā)酵支原體的106至10個(gè)基因組拷貝數(shù)。

                      圖2.用Bio-Rad CFX Manager軟件產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

                      總之,PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品可提供低拷貝數(shù)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品,因而可精zhun確定核酸法的檢測限。而10CFU的靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品只能觀察是否能達(dá)到這一閾值,而無法確定終為多少。從這個(gè)角度說,PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品具有自己*的優(yōu)勢。

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