介紹

腸桿菌科、大腸桿菌和大腸菌群是常見的食品傳染性細菌。對這些病原體的檢測和量化是微生物食品和臨床診斷實驗室的一項重要任務(wù)。

包括生化鑒定在內(nèi)的傳統(tǒng)的細菌檢測方法已經(jīng)應(yīng)用了很長時間。這些方法耗費時間和試驗材料。以前的研究顯示，大腸菌群，特別是大腸桿菌可作為食品和水污染的指示菌。它們的存在標示著飲用水和食品也受到了其他腸道病原菌的污染。因此在檢測食品衛(wèi)生方面，它們的分離和計數(shù)具有非常重要的作用。

ISO 6579-2003 描述了有關(guān)沙門氏菌在食品和飼料中的檢測方法，它一共包括四個步驟，并且需要確證試驗，需要持續(xù)5-7天，即：1.非選擇性液體培養(yǎng)基中的前增菌；2.液體培養(yǎng)基中的選擇性增菌；3.接種選擇性培養(yǎng)基；4.對可疑菌落進行血清學(xué)和生化鑒定。

沙門氏菌屬是導(dǎo)致胃腸炎的常見原因，對于它的檢測，需要從糞便樣本中分離病原菌。傳統(tǒng)使用乳糖、pH指示劑，用于鑒別沙門氏菌（非乳糖發(fā)酵菌）。然而，經(jīng)常有必要篩選許多其他的共生菌，如變形桿菌，它也不能發(fā)酵乳糖。篩選共生菌是一個耗時的過程，并且所需的血清學(xué)和生化鑒定試劑比較昂貴。

對天然污染食品樣品的分析顯示，用顯色培養(yǎng)基對菌落計數(shù)和分離更加容易，特別是對蠟樣芽孢桿菌。顯色培養(yǎng)基中包含人工添加的顯色底物，可被一些微生物特異的活性酶所裂解。

在過去30年中，一些病原菌靶向的高特異性顯色培養(yǎng)基開發(fā)出來了。這些培養(yǎng)基采用了酶底物，經(jīng)水解后釋放出生色染料，導(dǎo)致病原菌形成帶顏色的菌落，可輕易地與共生菌群相鑒別。理想狀況時，共生菌群應(yīng)被選擇性因子*抑制，或形成無色菌落，從而使靶向病原菌從背景菌群中“脫穎而出”。因此，它可區(qū)分含有這種酶的微生物和不含有這種酶的微生物。當樣本含有多種菌群時，這一點對于檢測特定的病原菌特別重要。而底物和水解產(chǎn)物對微生物生長不應(yīng)有抑制效應(yīng)。本次研究旨在評估兩種顯色培養(yǎng)基對于從食品中檢測和分離腸桿菌科的效率。

材料與方法

培養(yǎng)基制備

腦心浸出液肉湯（BHI,Difco labortaries, USA），選擇性培養(yǎng)基用于革蘭氏陰性菌，麥康凱瓊脂（Fluka BioChemika）,EMB瓊脂（HiMedia Laboratories）和四硫磺酸鈉煌綠肉湯(OXOID)用于大腸菌群和腸道致病菌，而亞硫酸鉍瓊脂（HiMedia）、HE瓊脂（OXOID）、XLD瓊脂（BD）和SS瓊脂（Biolife）用于分離沙門氏菌屬。

兩種用于檢測大腸桿菌和其他大腸菌群的顯色培養(yǎng)基進行了制備，分別為HiCrome ECC瓊脂(HIMEDIA)和沙門氏菌鑒別瓊脂（Raj Hans Medium, HIMEDIA）。每種顯色培養(yǎng)基制備時煮沸而不用高壓滅菌。

食品樣本

46個不同的食品樣本（雞蛋、色拉、奶制品、肉和加工過的大米）從伊拉克首都巴格達的當?shù)厥袌錾腺徺I。

用不同培養(yǎng)基分離細菌

每種樣本取25g加入到225ml生理鹽水，每種0.1ml樣本均液制備3個稀釋度，分別在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)。平板在37度孵育24小時，使顯色培養(yǎng)基中充分顯色。

生化分析

指數(shù)生長期的分離菌落用API 50 CHL試劑盒（梅里埃）進行分析，遵循說明書進行。

結(jié)果和討論

檢查了46種不同食物樣本。所有46個樣品都包含腸桿菌科的混合菌群，其中大腸桿菌（n=28）、肺炎克雷伯氏菌（n=7），沙門氏菌屬（n= 30）。在ECC和沙門氏菌鑒別瓊脂菌上，每個分離的菌落都表現(xiàn)為特定顏色。食品樣品的貯溶液含有多種類型的細菌，ECC瓊脂上鑒別的顏色如圖1所示。ECC上的大腸桿菌呈藍紫色（圖2）。

圖1.

圖2.

沙門氏菌在兩種顯色培養(yǎng)基上表現(xiàn)為：腸炎沙門氏菌在ECC上為無色菌落（圖3A），傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌在沙門氏菌鑒別瓊脂上是粉紅色（圖3B）。

圖3A

圖3B

肺炎克雷伯氏菌在沙門氏菌鑒別瓊脂上為藍色菌落（圖4A），在ECC上為綠色（圖4B）。

圖4 A

圖4 B

對分離的菌落初步鑒定是基于革蘭染色。麥康凱瓊脂能從形態(tài)上檢測到腸桿菌科。從食品樣本接種到增菌培養(yǎng)基如腦心浸液肉湯、麥康凱瓊脂、EMB瓊脂、BS瓊脂、HE瓊脂、TB肉湯、XLD瓊脂、SS瓊脂培養(yǎng)基上都出現(xiàn)腸桿菌科的大量生長，這使得難以分離疑似細菌。在比較用于腸桿菌科檢測的顯色培養(yǎng)基時，發(fā)現(xiàn)ECC和沙門氏菌鑒別瓊脂適合腸桿菌科成員，并適合用作食品中腸桿菌檢測的指示培養(yǎng)基。用顯色培養(yǎng)基（ECC沙門氏菌鑒別瓊脂）替代麥康凱瓊脂和EMB瓊脂培養(yǎng)基，會使背景菌下降大約50%，然而并不減少待測菌的菌落數(shù)量。

有趣的是，來自食物樣本的背景菌群受到強烈抑制。使用顯色培養(yǎng)基分離的沙門氏菌菌落，通過多價沙門氏菌抗血清得到證實，其血清型為特定的O和H。分離株的終確任是通過API 50試劑盒來確定腸桿菌科成員的糖發(fā)酵能力。它可用于腸桿菌科成員的鑒別。

近年來，生物技術(shù)的進步已經(jīng)導(dǎo)致食品檢測技術(shù)的改變。今天，我們受益匪淺于那些比傳統(tǒng)方法更特異、更快速且通常具有更高靈敏度的方法。含有乳糖的培養(yǎng)基，加上pH指示劑，傳統(tǒng)上用于從共生菌如大腸桿菌中鑒別出沙門氏菌。傳統(tǒng)顯色的原理是基于糖發(fā)酵，產(chǎn)生局部pH下降引發(fā)培養(yǎng)基中的指示劑顏色的變化。總的來說，我們實驗的結(jié)果顯示，兩種類型的顯色培養(yǎng)基有利于快速檢測食物中的細菌，并具有高度選擇性，不需要高壓滅菌，而傳統(tǒng)培養(yǎng)基則需高壓滅菌，非常耗時，而且價格貴，選擇性差。這些結(jié)果與其他人報告相一致（見注1）。

分離鑒定食品源性菌如腸桿菌科，在顯色培養(yǎng)基上為適合，這是因為由于這些菌的代謝活性與培養(yǎng)基中的底物反應(yīng)，使菌落產(chǎn)生顏色而得以分離。在許多研究中，顯色培養(yǎng)基已被證實顯示出超過傳統(tǒng)的培養(yǎng)基的優(yōu)勢，無論是目標病原菌的檢測率上，還是混合菌群的區(qū)分上。顯色培養(yǎng)基因為包含顯色底物，肯定要比傳統(tǒng)培養(yǎng)基更貴，但這可以通過減少對補充試劑的需求、減少與平板制備以及可疑菌落鑒定相關(guān)的勞動時間來抵消。由于這些因素，在診斷實驗室中使用顯色培養(yǎng)基日益廣泛。很可能在未來幾年內(nèi)針對更廣泛的病原體分離的顯色培養(yǎng)基越來越多。Hicrome ECC瓊脂和沙門氏菌鑒別瓊脂在快速檢測食品病原菌方面就是其中兩款翹楚。

結(jié)論

從這項研究中可見，ECC和沙門氏菌鑒別瓊脂顯示中高特異性和靈敏度，這與其他報告一致。然而，該研究的局限是只采用了兩款篩查腸桿菌的顯色培養(yǎng)基。也可能有其他替代品用于更便宜地對腸桿菌科進行日常檢查，以促進傳染病防控措施的啟動。

注1. Obeng-Nkrumah N, Twum–Danso K, Krogfelt KA, Newman MJ(2013). High levels of extended spectrum beta lactamase in a amajor teaching hospital in Ghana: The need for regular monitoring and evaluation of antibiotic resistance. Am. J. Trop. Med. Hyg. 98:960-964.

注2.該論文中提到的HiMedia生產(chǎn)的兩款顯色培養(yǎng)基，具體為

HiCrome ECC Selective HiVeg Agar Base（貨號MV1294）（需添加劑，貨號FD190）

Salmonella Differential HiVeg Agar（貨號MV1078）

出處：非洲微生物學(xué)研究（African Journal of Microbiology Research）. 2015，9(49): 2354-2357